Molekylærbiologiske forskning metoder og deres anvendelse

Molekylærbiologiske forskningsmetoder spiller en vigtig rolle i moderne medicin, retsmedicin, og biologi. Takket være fremskridt i studiet af DNA og RNA, personen er i stand til at udforske organismens genom bestemme det forårsagende middel, til at anerkende den ønskede nukleinsyre i en blanding af syrer, etc.

Molekylærbiologiske metoder. Hvad er det?

Tilbage i 70-80'erne af forskerne var den første til at dechifrere det menneskelige genom. Denne begivenhed gav impulser til udviklingen af gensplejsning og molekylær biologi. Undersøgelse af egenskaber af DNA og RNA har betydet, at det nu er muligt at anvende disse nukleinsyrer med henblik på sygdomsdiagnose, studie gen.

Fremstilling af DNA og RNA

Molekylærbiologiske diagnostiske metoder kræver udgangsmateriale: ofte denne nukleinsyre. Der er flere måder at vælge disse stoffer fra cellerne i levende organismer. Hver har sine fordele og ulemper, og det bør overvejes ved valg af en fremgangsmåde til isolering af nukleinsyrer i ren form.

1. Fremstilling af DNA ved Marmur. Fremgangsmåden består i at behandle blandingen af alkohol stoffer, udfælder resulterende rent DNA. Ulempen ved denne fremgangsmåde er anvendelsen af ætsende stoffer, phenol og chloroform.

2. Isolering af DNA på bommen. Det vigtigste stof, der bruges her - er guanidinthiocyanat (GuSCN). Det fremmer aflejringen af deoxyribonucleinsyre på specialiserede substrater, hvorfra det efterfølgende kan indsamles ved hjælp af en særlig puffer. Dog GuSCN - er en inhibitor af TCP, og selv en lille del af det bliver deponeret i DNA kan påvirke forløbet af polymerasekædereaktionen, hvilket er vigtigt, når man arbejder med nucleinsyrer.

3. Udfældning af urenheder. Fremgangsmåden adskiller sig fra de tidligere ved, at molekylerne selv ikke afsættes dehoksiribonukleinovoy syre og urenheder. For at gøre dette, skal du bruge ionbyttere. Ulempen er, at ikke alle stoffer kan bundfælde sig.

4. Mass screening. Denne metode anvendes i tilfælde, hvor du ikke behøver at have præcise oplysninger om strukturen af DNA-molekylet, og behovet for at få nogle statistikker. Årsagen er, at nukleinsyren struktur kan blive beskadiget ved håndtering detergenter, især alkalier.

Klassificering af forskningsmetoder

Alle molekylærbiologiske metoder til forskning er opdelt i tre hovedgrupper:

1. Amplifikation (anvendelse af en flerhed af enzymer). Dette omfatter PCR - polymerasekædereaktion, som spiller en vigtig rolle i mange af de diagnostiske metoder.

2. Neamplifikatsionnye. Denne gruppe metoder er forbundet direkte med arbejdet i nukleinsyreblandinger. Eksempler er 3 slags blots, in situ hybridisering, etc.

3. Metoder baseret på anerkendelse af signalet fra probemolekyle, der binder til en specifik DNA- eller RNA-probe. Eksempel - hybridiseringssystemet Hybride Capture System opløsning (VK2).

Enzymer, der kan anvendes i molekylærbiologiske forskning metoder

Mange molekylære diagnostiske teknikker involverer anvendelsen af en bred vifte af enzymer. Nedenfor bruges oftest:

1. restriktionsenzym - "cut" DNA-molekylet til de nødvendige dele.

2. DNA-polymerase - syntetiserer en dobbeltstrenget deoxyribonucleinsyremolekyle.

3. Revers transkriptase (revers transkriptase) - anvendt til at syntetisere DNA fra en RNA-template.

4. DNA-ligase - er ansvarlig for dannelsen af phosphodiesterbindinger mellem nukleotider.

5. exonuklease - fjerner nukleotider fra endedelene af den deoxyribonucleinsyremolekyle.

PCR - den grundlæggende fremgangsmåde til DNA-amplifikation

Polymerasekædereaktion (PCR) er meget udbredt i moderne molekylær biologi. Denne fremgangsmåde, hvor en enkelt DNA-molekyle kan der opnås et stort antal kopier (amplifikation molekyle).

De vigtigste funktioner i PCR:

- diagnose af sygdomme;

- kloning af DNA-segmenter, Gene.

Til udførelse af polymerasekædereaktionen kræver følgende elementer: initial DNA molekyle, en termostabil DNA-polymerase (Taq eller Pfu), deoxyribonukleotid phosphater (nitrogenkilder baser), primerne (2 primer 1 DNA-molekyle), og selv et puffersystem, som kan udføre alle reaktioner.

PCR består af tre trin: denaturering, primerannealing og forlængelse.

1. denaturering. Ved en temperatur på 94-95 grader Celsius proshodit bryde hydrogenbindinger mellem de to kæder af DNA, og som følge heraf får vi to enkeltstrengede molekyler.

2. annealede primere. Ved en temperatur på 50-60 grader forekommer tiltrædelsesforhandlinger primere ved enderne af enkeltstrengede nukleinsyremolekyler ifølge typen af komplementaritet.

3. Forlængelse. Ved en temperatur på 72 grader syntetiseres datter dobbeltstrenget desoxyribonucleinsyre-molekyler.

DNA-sekventering

Molekylærbiologiske forskning metoder kræver ofte kendskab til sekvensen af nukleotider i et molekyle af desoxyribonucleinsyre. For at bestemme den genetiske kode sekventeret. Molekylær diagnostik i fremtiden vil være baseret på den opnåede viden i bestemmelsen af den humane sekvens.

Følgende typer sekventering:

• sekventering ved Maxam-Gilbert-;
• Sanger-sekventering;
• pyrosekventering;
• nanoporovoe sekventering.